证明一个分子具有特定功能表型的方法，通常通过分子操作，人为改变分子表达，观察表型变化。主要分为两种方式：
第一种为“获得功能”（gain of function），如过表达（over expression），即增加目标分子的表达量，观察其对生物体或细胞的影响；
第二种为“丧失功能”（loss of function），如沉默（silence）或敲除，针对低表达的基因，通过抑制其表达，研究其功能。
在研究疾病相关基因时，若基因在疾病中高表达，通常采用抑制和下调手段，反之，对于低表达基因，则采取上调和过表达方法。这种一正一反的研究逻辑，是证明分子功能表型的有效途径。
生物系统复杂多样，不同细胞株中基因表达存在差异。在研究特定分子功能时，需首先检测其在不同细胞株中的表达水平与本底状态，然后在高表达的细胞株中应用沉默技术，低表达细胞株则采用过表达策略。
实现分子过表达的方法有质粒与病毒两种。质粒是一种包含结构元件的环状DNA分子，可将特定序列的DNA基因表达出来。通过脂质体转染技术，将质粒导入细胞，实现基因表达。这一过程类似于利用卡车运输货物，但面对恶劣条件时，需采用更坚固的运输方式，即病毒介导的基因传递，尤其适用于难以转染的细胞，如神经细胞与干细胞。
沉默分子的方法主要为RNA干扰技术（RNAi），通过脂质体将21个碱基的sRNA转染至细胞，高效且特异地阻断目标基因的表达。sRNA与细胞内蛋白复合体结合，识别互补配对的mRNA，利用核酸内切酶活性将其切割降解，达到沉默目的。
设计sRNA时，可参考基因的多个候选序列，通常选择3条，以提高实验效果。RNAi实验中，需预先筛选有效sRNA，确保目标基因被高效沉默。
RNAi技术虽强大，但未来5年可能被CRISPR技术取代。CRISPR技术通过设计指导RNA（gRNA）与辅助蛋白Cas9共同作用，实现基因敲除。与RNAi相比，CRISPR技术操作更为便捷，只需额外导入Cas9蛋白，且该蛋白在细胞中预先制备，便于重复使用。
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回答时间：2025-02-04 20:23
