慢病毒操作手册

慢病毒操作手册：

慢病毒使用操作：

1.1.1病毒的储存：慢病毒建议在4摄氏度保存，若需长期保存应置于-80摄氏度。病毒应存于冻存管中，并使用封口膜封口。储存6个月以上的病毒，在使用前应重新测定病毒滴度。反复冻融会降低病毒滴度，每次冻融降低10%。为避免多次冻融，建议按照每次使用量进行分装。

1.1.2病毒的稀释：取出病毒于冰浴中溶解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基稀释，混匀分装后在4摄氏度保存。确保在三天内使用。

1.2慢病毒用于体外实验：感染原代细胞和建系细胞时，需要了解慢病毒对目的细胞的亲嗜性、感染复数（MOI值）以及体注射所需的病毒量。如果无法查阅相关文献，可通过感染预实验确定合适的MOI值。

1.2.2慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：
A. 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞（HEK293T，Hela）作为对照。
B. 稀释病毒时，可用完全培养基稀释，血清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。
C. Invabio提供的病毒单位为TU/ml，表示每毫升含有具有生物活性的病毒颗粒数。病毒滴度>1X108 TU/ml，每毫升至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

1.2.2.2以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T细胞的感染预实验：
实验前设置不同MOI的感染孔，计算所需的病毒量，必要时使用PBS溶液或无血清培养基稀释病毒原液。第一天准备细胞，接种目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右。第二天准备病毒，取出后使用台式离心机离心，离心后将病毒加入细胞培养基中，混匀后放入二氧化碳培养箱孵育过夜。确保细胞生长状态良好。

慢病毒操作安全使用规范：
Invabio提供的慢病毒为“自杀”性病毒，不感染其他细胞，也没有毒性作用。但应避免使用可能致癌的基因。使用时，请穿戴实验服、口罩和手套，并在生物安全柜中操作。操作时避免气雾或飞溅，使用70%乙醇清洁污染物品。使用显微镜观察细胞感染情况时，拧紧培养瓶或盖紧培养板，清理后进行观察。离心时使用密封性好的离心管或封口膜封口。

悬浮细胞感染方法概要：
根据细胞数量离心收集细胞，用无血清培养液稀释，确保细胞完全浸没在培养基中。按照MOI计算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，孵育30分钟后转移至培养皿或孔中，加入新鲜培养液。12小时后更换培养液，96小时后观察细胞阳性率。

相关专业术语：
MOI（Multiplicity of Infection）：感染复数，表示感染时病毒与细胞数量的比值。推荐MOI范围为0.1至0.01，确保每个细胞至少感染一个病毒颗粒。然而，多个病毒颗粒可能感染同一细胞，导致部分细胞未感染。使用较高MOI可减少未感染细胞的比例。

细胞培养器皿的相关参数：
- Flask/Dish：不同尺寸的培养皿对应不同细胞数量和培养基体积。
- 96 well plate：50 μl至200 μl，1.5至5.0×104个细胞。
- 48 well plate：200 μl，3.0×104至1.0×104个细胞。
- 24 well plate：500 μl，8.0×104至2.0×104个细胞。
- 12 well plate：1.0 ml，1.6至4.0×104个细胞。
- 6 well plate：2.0 ml，3.0至8.0×104个细胞。
- 35mm：2.0 ml，3.0至8.0×104个细胞。
- 60mm：6.0 ml，1.0至2.5×104个细胞。
- 100mm：10.0 ml，2.5至6.4×104个细胞。

慢病毒载体的包装与纯化：
实验流程包括制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，培养后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液。感染Hela细胞后，定量PCR检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。

实验材料与主要仪器包括包装细胞、菌株、主要试剂与仪器。实验材料包括慢病毒载体、包装细胞和菌株，以及用于扩增质粒的试剂和仪器。主要仪器如PCR仪、电泳仪、荧光倒置显微镜、冷冻超速离心机等。

慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱涉及四质粒系统，包括穿梭质粒、pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G，以及目的穿梭质粒能表达绿色荧光蛋白（GFP）。每个质粒包含病毒包装所需的元件。

慢病毒生产实验步骤包括慢病毒包装细胞转染、制备四种质粒DNA溶液、转染后的细胞培养、收集转染后的上清液、上清液的离心、过滤、离心等步骤。实验过程中需使用胰蛋白酶消化细胞，转染DNA和磷酸钙混合液，然后收集和处理上清液。最终得到的慢病毒浓缩液可用于感染Hela细胞，通过定量PCR检测病毒滴度。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

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