引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。
遵循原则如下：
1. 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。
2. 引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。
3. 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。
4. Tm值：引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃ -65℃为佳。
5. 碱基的分布：引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。
6. 序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。
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回答时间：2024-05-06 09:10
