时间分辨荧光技术有基于时域和基于频域两种测量方法。由于时间分辨结果数据包含有比稳态荧光数据更多的信息,近年来,时间分辨荧光技术已成为生物化学与生物物理领域的主要研究工具之一。荧光寿命成像技术可以同时获得分子状态以及空间分布的信息,在生物学和医学领域也得到了越来越广泛的应用。以下将从原理、仪器及应用等方面,简要介绍时间分辨荧光以及荧光寿命测量技术。
1，荧光及荧光寿命的基本原理
分子吸光后去活化的原理与过程,可以直观的用Perrin2Jablonsky图表示(图1是一种简化表示)。简言之,分子中处于单线态基态电子能级S0的电子,依据Frank2Condon规则吸收一定波长的光子后,被激发至单线态激发态电子能级(一般是S1态)中的某一振动能级,这一过程约10-15s;在经历短暂的振动弛豫过程后(约10-12～10-10s),会有大量电子在S1态的最低振动能态积累。这一状态的电子会有几种释放能量,回到基态S0态的途径,包括振动弛豫在内的这些途径被统称为去活化的过程。若能量释放的过程中伴随着光子的放出,则称为辐射去活;若只是通过碰撞等途径释放能量,而没有光子放出,则称为无辐射去活。

荧光发射即为一种常见的辐射去活过程,它通常是指电子发生自S1态至S0态的跃迁,同时放出光子的过程,这一过程的时间通常在10-10～10-7s。利用光学仪器检测荧光发射的强度随时间的变化,即可得到体系的荧光寿命信息。
无辐射去活过程有以下几种途径:内转换指的是电子在具有相同多重度的电子能态间发生跃迁的过程,时间通常在10-11至10-9s;系间跨越指的是电子在不同多重度的能态间发生跃迁的过程,如单线态S1至三线态T1的跃迁,其时间通常在10-10～10-8s;荧光猝灭指的是激发分子通过分子间的相互作用和能量转换,从而释放能量的过程,也称作外转换。这些无辐射去活过程在决定体系的荧光寿命时起非常重要的作用。
此外,电子跃迁至T1态后,也有一定几率以放出光子的形式跃迁至S0态,称作磷光发射;或再次系间跨越回S1态,并放出一个光子回到S0态,称作延迟荧光。限于篇幅,这两类发光情况不在此作讨论。
2，荧光衰减曲线及荧光寿命
在激发光源的照射下,一个荧光体系即向各个方向发出荧光;当光源停止照射时,荧光不会立即消失,而是会逐渐衰减至0。基于以上原理,可以对一个理想体系的荧光衰减进行严格的数学推导。
对于荧光物质A的稀溶液,设其浓度为[A](mol·L-1),假设所有A分子所处的环境近似,则溶液中所有A分子的荧光衰减途径相同。有一束时间很短的脉冲光,若其持续时间与过程中涉及的速率常数相比可忽略不计,则可认为其时间宽度为0,这种理想的线光源被称作δ2脉冲。以δ2脉冲激发上述溶液,由于光吸收与振动弛豫的时间很短,则可认为在时间为0时,一定数量的A分子就通过吸收光子,而到达了激发态S1,浓度用[1A3]表示。这些处于激发态的分子,会通过辐射(在这里即指荧光)或无辐射的途径返回基态S0,其速率常数分别用kSr和kSnr表示。此过程可与一级反应类比,激发态分子的衰减速率可用式(1)表示:
-d[1A3]dt=(kSr+kSnr)[1A3](1)
对式(1)进行积分,即可得到时间t时激发态分子浓度与初始激发态浓度[1A3]0间的关系:
[1A3]=[1A3]0exp-tτS(2)
式中的τS称作激发态S1的寿命,用式(3)表示:
τS=1kSr+kSnr(3)
荧光强度IF与激发态分子的浓度以及荧光辐射去活的速率常数成正比:
IF(t)=kSr[1A3]=kSr[1A3]0exp-tτS(4)
用荧光仪器测量时,观测到的荧光强度IF还与仪器的各参数有关。因此,荧光强度与激发态寿命的关系可简单表示为:
I(t)=αexp-tτ(5)式(5)
表明,以δ2脉冲作为激发光源的单一体系中,荧光强度呈单指数衰减。而观测到的荧光寿命τ与S1态的寿命τS等价,不仅受荧光发射速率的影响,还受各种非辐射过程的影响,所以直接测得的表观荧光寿命也称作自然寿命。
对于复杂体系,由于其中各荧光物质的性质或所处微观环境不同,整个体系的荧光衰减曲2线为多个指数衰减函数的加和,称多指数衰减:
I(t)=∑iαiexp-tτi(6)
以上的荧光衰减曲线,是基于激发光源为理想线光源δ2脉冲的情况下得到的(图2)。

实际上,任何实际光源都有一定的宽度,因此在实际应用中,上述表达式还需要做进一步修正。若将激发光源的强度表示为时间的函数E(t),则检测到的信号R(t)可表示为E(t)与δ2脉冲响应I(t)间的卷积分:
R(t)=E(t)ªI(t)=∫t0E(t′)I(t-t′)dt′(7)
根据以上理论推导得到的结论,可设计荧光寿命的检测仪器,解析测量结果,进一步得到体系的动力学信息。
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回答时间：2023-10-23 15:37
