一文读懂荧光定量PCR(建议收藏)

荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过实时检测扩增反应中每一个循环产物的荧光信号，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例，PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，逐渐取代了传统的PCR技术。在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，之后反应会进入指数增长期，此时，可设定一条荧光阈值线，根据荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数计算出CT值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且具有重现性。

Ct值可以用于计算目的基因的表达量，其中包含绝对定量和相对定量两种方式。绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。Ct值可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

在荧光定量PCR中，对照的使用是为了对检测的各个环节进行监控。常规荧光定量PCR的流程包括样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。在这一过程中，可以使用阳性对照和阴性对照、扩增对照、内标（Internal Control）、核酸提取对照、反转录对照、空白对照、质控品（Quality control, QC）和定值参考品。选择和搭配合适的对照，可以对从提取到扩增的各个环节进行监控，提高检测的准确性。

荧光定量PCR在分子生物学研究中有广泛的应用，包括核酸定量分析、基因表达差异分析、SNP检测、甲基化检测等。在医学研究领域，荧光定量PCR用于产前诊断、病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测等多个方面。这项技术具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点，广泛应用于科研和临床实践中。

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