转录组分析(三)Hisat2+StringTie+Ballgown

本文聚焦于使用Hisat2、StringTie与Ballgown进行RNA-seq分析的技术流程，该流程基于2016年Nature Protocols上发表的《Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown》一文。分析主要涉及三个软件工具，用于转录组研究。

1. HISAT：ccb.jhu.edu/software/hi... HISAT利用大量FM索引，能快速比对RNA-Seq读取与基因组，相较于STAR、Tophat，它在比对速度和内存使用上更具优势。

2. StringTie：ccb.jhu.edu/software/st... 该工具应用流神经网络算法及可选的de novo组装，用于转录本组装与表达水平预测。相较于Cufflinks，StringTie在基因重建的完整性和表达水平预测上表现更佳。

3. Ballgown：github.com/alyssafrazee... 是R语言中用于基因差异表达分析的工具，能利用StringTie、RSEM、Cufflinks等结果预测基因、转录本的差异表达。

该流程包含多个关键步骤，以确保全面且准确的转录组分析：

使用HISAT将读段匹配到参考基因组上，支持提供注释文件，并检测注释文件未列出的剪切位点。

比对结果由StringTie处理，进行转录本组装，每个样本独立组装，并估算基因及isoform的表达水平。

StringTie的merge函数整合所有样本的转录本，确保所有样本中都存在的转录本，便于后续比较。

merge数据再次输入StringTie，进行转录本丰度再估算，提供给Ballgown进行进一步分析。

Ballgown根据实验条件，分析并统计基因、转录本的差异表达。

Hisat2比对与Samtools处理：通过脚本将sam文件转换为bam文件，作为StringTie的输入。

StringTie组装与预测新基因：使用StringTie组装转录组，生成gtf文件记录转录本信息，合并为单个gtf文件，与已知注释文件比较筛选新基因。

筛选新基因：通过GTf文件中的class codes筛选新转录本，特别关注内含子区、基因间区及已知外显子的反义链转录本。

转录本序列转换：通过特定代码生成新基因的gff或gtf格式文件及转录本序列，用于后续分析。

TransDecoder预测CDS：识别转录本序列中的潜在编码区域，预测蛋白质编码区。

过滤：设定50的ORF长度阈值，过滤掉较短的编码蛋白新基因，降低假阳性率。

合并已知基因与预测基因：整合所有基因，包括已知和预测的新基因。

准备Ballgown文件：利用StringTie生成的表达文件作为Ballgown的输入。

差异分析：参考Ballgown官网说明进行，执行差异表达分析，识别基因、转录本的显著差异。

通过这一系统化的流程，研究人员能够深入解析转录组数据，发现新的转录本、预测编码区，并识别基因表达差异，为后续的生物学研究提供重要信息。

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